Комплексный мониторинг генетического статуса детей, проживающих на территориях Брянской области, загрязненных радионуклидами в результате аварии на Чернобыльской АЭС

Н.С. Кузьмина, И.И. Сусков
канд. биол. наук
(Институт общей генетики
им. Н.И. Вавилова РАН, Москва),
В.П. Садовников,
канд. физ.-мат. наук,
М.В. Сорочинский
(Фрязинское отделение
Института радиотехники и электроники
РАН, Московская обл.)

Введение

В результате аварии в апреле 1986 г. на Чернобыльской АЭС (ЧАЭС) обширные территории России, Украины, Белоруссии оказались загрязненными радионуклидами, а большие контингента детского и взрослого населения подверглись и продолжают подвергаться низкоинтенсивному действию малых доз радиации. Если 131 как короткоживущий радионуклид с периодом полураспада несколько суток являлся существенным фактором облучения населения в апреле-мае 1986 г., то основной вклад в дозу облучения в отдаленные сроки после аварии вносят такие долгоживущие радионуклиды как ¹³⁴Cs, ^I37Cs, ⁹⁰Sr, ²³⁸Pu, ²³⁹Pu, ²⁴⁰Pu, ²⁴¹Pu, ²⁴¹Am с периодом полураспада от 2 лет до 24 тыс. лет [1]. В последние годы наблюдается повышение заболеваемости, тенденция к хронизации болезней, учащение случаев развития иммунодефицитных состояний, анемизации, злокачественных новообразований и нервно-психической дезадаптации, причем наиболее выражены эти соматические эффекты у детей, растущий организм которых обладает наибольшей радиочувствительностью [2, 3]. Поэтому в настоящее время наиболее актуальной является проблема эколого-генетических последствий хронического действия малых доз радиации, т. к. геном, будучи фундаментальной структурой клетки, определяющей нормальное развитие и функционирование организма, является огромной чувствительной мишенью для у-квантов и ионизирующих частиц.

Необходимо отметить, что в последние 10 лет в радиобиологических исследованиях, в том числе с использованием методик клеточного клонирования, твердо установлено, что помимо прямых мутагенных эффектов, ионизирующая радиация приводит к индукции в потомках облученных многократно поделившихся клеток геномной нестабильности в виде различных нарушений генетического аппарата (разрывов ДНК, структурных аберраций хромосом, генных мутаций, сестринских хроматидных обменов (СХО), анеуплоидий, полиплоидии) [4...7]. Также появились сведения о повышенной радиочувствительности хромосом в клетках потомства облученных родителей [8].

В связи со сказанным ранее проведен комплексный генетический мониторинг детей, проживающих в условиях низкоинтенсивного действия малых доз радиации, в том числе родившихся после аварии от облученных родителей.

Материалы и методика.

К настоящему времени обследовано 85 детей, постоянно проживающих на территориях с плотностью загрязнения свыше 15 Ku/км2 по ¹³⁷Cs (Новозыбковский район Брянской обл.): родившиеся до аварии (31 чел.), облученные внутриутробно в 1986г. (14 чел.), родившиеся после аварии от облученных родителей в 1987-1992 гг. (19 чел.) и 1994-2000 гг. (21 чел.). В когорте детей, родившихся до аварии, была выделена особая группа детей (13 чел.), получивших в 1986 г. высокую дозовую нагрузку на щитовидную железу (200 Бэр и выше). Сроки проживания детей на загрязненных радионуклидами территориях составляли 1,5... 16 лет. Контрольную группу составили дети, проживающие в чистых районах (16 чел.). Все обследованные дети наблюдались в Федеральном детском научно-практическом центре противорадиационной защиты МНИИПДХ МЗРФ (руководитель Центра - проф. Л.С. Балева).

Работу проводили на лимфоцитах крови детей методом цитогенетического анализа, который широко используется в генетических исследованиях для эффективного выявления последствий воздействия различных радиационных факторов на организм человека. Культивирование лимфоцитов периферической крови и приготовление препаратов для цитогенетического анализа проводили по общепринятым методикам, рекомендованным ВОЗ и МАГАТЭ [9, 10]. Осуществляли общий и специальный кариотипический анализ аберраций хромосом в 48-часовых культурах лимфоцитов. У 15 детей проводили идентификацию порядкового номера митоза и подсчет частоты СХО с добавлением в культуры 5-БДУ.

Фено -/генотипы мономорфных (альбумин, Alb; гемоглобин a,b, Hb, Hb; эстераза А,В, EsA, EsB; фосфоглюкомутаза-2, PGMa) и полиморфных (гаптоглобин, Нр; трансферрин, Tf; группо-специфический компонент, Gc; эстераза D, EsD; кислая фосфотаза, АсР; 6-фосфоглюконатдегидрогеназа, 6-PGD; фосфоглюкомутаза-1, PGMO белков/ферментов, кодируемых аллелями 13 локусов, определяли по электро-фореграммам в гистохимически-окрашенных акриламидном и крахмальном гелях [И]. Всего выполнено 1 404 локус-тестов, охватывающих 2 808 аллелей.

Статистическую обработку экспериментальных результатов проводили на основе пакета специализированных прикладных программ, адаптированных к задачам генетического мониторинга.

Результаты и обсуждение

На рис. 1 представлено распределение детей-носителей различных видов хромосомных аберраций. У большинства детей, проживающих в чистых районах (контрольная группа), обнаружены одиночные хроматидные фрагменты-аберрации, характерные для спонтанного мутагенеза, и только два ребенка (12,5 %) являлись носителями парных хромосомных фрагментов. Во всех обследованных группах детей, проживающих в условиях низкоинтенсивного действия малых доз радиации, выявлены радиационно-индуцированные аберрации хромосом (парные фрагменты, центромерные разрывы, делеции, дицентрики, кольца, реципрокные транслокации, инверсии), однако доля детей-носителей этих хромосомных нарушений в разных возрастных группах оказалась различной. Видно, что самая высокая доля лицносителей простых аберраций хромосомного типа (парных фрагментов, центромерных разрывов, делеции) выявлена в группе детей 1982 г. - начало 1986 г. рождения, получивших в момент аварии высокую дозовую нагрузку на щитовидную железу (зарегистрированная доза составляла 200 Бэр и выше). Доля детей-носителей парных фрагментов, центромерных разрывов, делеции в группах внутриутробно облученных детей и детей, родившихся после аварии в 1987-1992 гг., несколько выше, чем группах детей 1982 г. - начало 1986 г. рождения, (с необлученной щитовидной железой) и 1994-2000 гг. рождения.

Видно, что у большинства детей 1982 г. - начало 1986 г. рождения, получивших в момент аварии высокую дозовую нагрузку на щитовидную железу, выявлены сложные обменные хромосомные перестройки (дицентрики, кольца, реципрокные транслокации, инверсии) - объективные маркеры радиационного воздействия. Доля лиц-носителей этих хромосомных перестроек в других обследованных группах детей оказалась в два-три раза меньше. У детей 1987-1992 гг. рождения эти аберрации встречались чаще, чем у детей 1982 г. начало 1986 г. рождения (с необлученной щитовидной железой), детей, подвергшихся внутриутробному облучению в 1986 г., и у детей 1994-2000 гг. рождения. Наименьшая доля носителей этих сложных хромосомных перестроек была в группе детей 1994-2000 гг. рождения, длительность проживания которых на территориях, загрязненных радионуклидами, была в среднем в три-четыре раза меньше, чем у детей других групп. Во всех группах обследованных детей, проживающих в условиях хронического действия радиации в малых дозах, чаще, чем в контрольной группе, встречались носители спорадических анеуплоидных и полиплоидных клеток.

В табл. 1 представлены обобщенные данные по спектру и частотам цитогенетических нарушений, выявленных в перечисленных ранее группах детей. Видно, что размах индивидуальных частот аберрантных клеток, простых и обменных аберраций хромосомного типа, а также разрывов хроматид у детей, проживающих в условиях длительного низкоинтенсивного действия малых доз радиации выше, чем в контрольной группе. Средние уровни этих цитогенетических нарушений достоверно превышают таковые показатели в контрольной группе, за исключением детей 1994-2000 гг. рождения, у которых не выявлено достоверных различий по сравнению с контролем для частот аберрантных метафаз и хромосомных перестроек обменного характера. Достоверно повышенные по сравнению с контрольным уровнем частоты хроматидных фрагментов обнаружены только у внутриутробно облученных детей. Аналогичный спектр хромосомных нарушений, частоты которых существенно повышены, отмечены у детей, подвергшихся постнатальному облучению в 1986 г. и постоянно проживающих на территориях Украины, загрязненных радионуклидами после аварии на ЧАЭС [12].

Наибольшие частоты хромосомных аберраций и аберрантных геномов выявлены у детей 1982 г. начало 1986 г. рождения с высокой дозовой нагрузкой на щитовидную железу, причем по частотам аберрантных клеток, простых и обменных аберраций хромосомного типа, а также разрывов хроматид выявлены достоверные по критерию Манна-Уитни [13] различия по сравнению с таковыми показателями в группе детей с необлученной щитовидной железой ( р= 0,002, 0,034, 0,031 и 0,002 соответственно). Аналогичные результаты получены и при обследовании детей, проживающих на территориях Калужской обл., загрязненных радионуклидами после аварии на ЧАЭС [14].

Не выявлено достоверных различий по всем рассмотренным цитогенетическим показателям (р=0,05) у детей - жителей территорий с радионуклидными загрязнениями: родившихся до аварии (с необлученной щитовидной железой), подвергшихся внутриутробному облучению и детей, родившихся после аварии от облученных родителей. Однако, несмотря на определенную ограниченность объемов выборок обследованных детей отмечена тенденция к повышению средних частот аберрантных геномов, хроматидных фрагментов и разрывов хроматид у детей, подвергшихся внутриутробному облучению, и у детей, родившихся после аварии в 1987-1992 гг. Уровень аберраций хромосомного типа у последних несколько превышал аналогичный показатель в других обследованных группах. Кроме того, у детей 1987-1992 г. рождения отмечен более высокий размах межиндивидуальной вариабельности частот аберрантных геномов и хроматидных фрагментов, чем у детей 1982 г. - начало 1986 г. рождения (с необлученной щитовидной железой), у детей, подвергшихся внутриутробному облучению, и у детей 1994-2000 гг. рождения. Размах индивидуальных частот аберраций хромосомного типа и разрывов хроматид у детей 1987-1992 гг. рождения и 1994-2000 гг. рождения оказался несколько выше, чем таковой показатель в двух других группах. Средние частоты и дисперсии частот аберрантных метафаз и аберраций хромосомного типа у разных групп детей представлены на рис. 2.

Заслуживает внимания факт, что хромосомные нарушения наблюдаются и у детей 1994-2000 гг. рождения, подвергшихся наименьшему непосредственному воздействию радиационного фактора, но родившихся от родителей, находившихся в момент аварии в подростковом возрасте, который рассматривается как один из наиболее уязвимых периодов онтогенеза [15]. По-видимому, у определенной части обследованных детей, помимо прямых мутагенных эффектов радиации, имеет место и трансгенерационный феномен геномной нестабильности соматических клеток, о чем свидетельствует как невысокая корреляционная связь между частотами аберрантных геномов у детей 1987-2000 г рождения и их матерей (г=0,41, =0,028) (рис. 3), так и большой размах межиндивидуальной вариабельности частот цитогенетических нарушений у детей, родившихся от облученных родителей.

У большинства детей-носителей радиационно-индуцированных хромосомных аберраций также снижена репарационная активность геномной ДНК либо после у-, либо после УФ облучения, однако нарушения после у-воздействия преобладают [16].

В настоящее время нами проводится изучение частоты СХО у детей, проживающих в условиях низкоинтенсивного действия малых доз радиации. В табл. 2 представлены частоты СХО в лимфоцитах внутриутробно облученных детей и детей, родившихся после аварии в 1987-1991 гг. от облученных родителей. Существенных различий в частотах СХО между группами этих детей не выявлено.

Хотя в обоих группах частота СХО в метафазах 2-го митоза (обмены 1-й 2-го клеточных циклов) не отличалась от контрольного уровня, в лимфоцитах 3-ей клеточной генерации уровень реципрокных СХО (обмены 3-го клеточного цикла) оказался достоверно повышенным, что связано с появлением геномов с высоким количеством СХО (вплоть до 20). Полученные данные свидетельствуют об индукции в потомках поделившихся клеток геномной нестабильности на уровне молекул ДНК.

На рис. 4 показано распределение по уровням индивидуальной гетерозиготности детей и их родителей, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами. Если в группе родителей-носителей сложных обменных аберраций хромосом доля дигетерозиготных генотипов резко снижена по сравнению с таковой в общей группе, то у детей доля генотипов со средней индивидуальной гетерозиготностью снижена в обоих когортах. Кроме того, у детей доля полигетерозиготных генотипов значительно превышает таковой показатель у родителей. Полученные данные, с одной стороны, свидетельствует о генотипическом фоне организма в индукции хромосомных аберраций, а с другой - о том, что уровень генной комбинаторики влияет на биологическую устойчивость организма, т.к. следует отметить, что все дети на момент обследования имели отклонения в состоянии здоровья. Полученные данные согласуются с концепцией оптимального уровня популяционной гетерозиготности [17].

Заключение.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Справочник по радиационной обстановке и дозам облучения в 1991 г. вследствие аварии на Чернобыльской АЭС / Под ред. М.И. Балонова. Институт радиационной гигиены ГКСЭН РФ. СПб.: Ариадна-Аркадия, 1993.
2. Балева Л.С., Кузьмина Т.Е., Сипягина А.Е. и др. Состояние здоровья первого поколения детей, родившихся от родителей, подвергшихся воздействию ионизирующих излучений в подростковом возрасте и продолжающих проживать на территориях, загрязненных радионуклидами. Экологическая антропология: Ежегодник. Матер. IX-ой межд. науч. - практ. конф. "Экология человека в постчернобыльский период". 27-29 сентября 2001 г.
3. Здоровье детей и радиация: актуальные проблемы и решения. / Под ред. Л.С. Балевой, А.Д. Царегородцева. М.: Медиа Сфера, 2001.
4. Kadhim M.A., MacDonald D.A., Goodhead D.T. et al. Transmission of chromosomal instability after plutonium a-particle irradiation // Nature. 1992. Vol. 355.
5. Ponnajya B., Cornforth M.N., Ullrich R.L Induction of chromosomal instability in human mammary cells by neutrons and у-rays//Radial. Res. 1997. Vol. 147.
6. Пелевина И.И., Готлиб В.Я., Кудряшова O.B. и др. Свойства потомков облученных клеток // Цитология. 1998. Т. 40. №5.
7. Сусков И.И., Кузьмина Н.С. Проблема индуцированной геномной нестабильности в детском организме в условиях длительного действия малых доз радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41. Вып. 5.
8. Воробцова И.Е., Воробьева М.В., Корытова Л.И., Шуст В.Ф. Исследование цитогенетической реакции лимфоцитов на облучение in vitro у детей, рожденных пациентами после противоопухолевой лучевой и химиотерапии // Цитология. 1995. Т. 37. № 5/6.
9. Бактон К., Эванс Г. Методы анализа хромосомных аберраций у человека. Женева: ВОЗ, 1975.
10. Biological dosimetry: chromosomal aberration analysis for dose assessment. Technical reports series № 260. Vienna: Int. Atomic Energy Agency, 1986.
11. Harris H., Hopkinson D.A. Handbook of enzyme electro-foresis in human genetics. Amsterdam. NH Publ. со. 1978.
12. Пилинская М.А., Дыбский С.С., Знаевская И.А., Дыбская Е.Б. Динамика протекания мутационного процесса в лимфоцитах периферической крови человека в условиях постоянного воздействия малых уровней ионизирующей радиации // Цитология и генетика. 1995. Т. 29. №. 3.
13. Медик В.А., Токмачев М.С., Фишман Б.Б. Статистика в медицине и биологии. М.: Медицина, 2000.
14. Севанькаев A.B., Потетня О.И., Жлоба A.A. и др. Результаты цитогенетического обследования детей и подростков, проживающих в загрязненных радионуклидами районах Калужской области // Радиационная биология. Радиоэкология. 1995. Т. 35. Вып. 5.
15. Сусков И.И., Кузьмина Н.С., Иофа Э.Л. и др. Дисгеномные эффекты у детей, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами. Междунар. конф. "Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций". Москва. 10-13 июня 2002.
16. Сипягина А.Е. Значение синдрома индивидуальной радиационной чувствительности для формирования патологических состояний у детей. Здоровье детей и радиация: актуальные проблемы и решения. / Под ред. Л. С. Балевой, А. Д. Царегородцева. М.: Медиа Сфера, 2001.
17. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М.: Наука, 1990.